هر جفت کروموزوم که در کاریوتایپ مشاهده می شود به نظر می رسد که دارای نوارهای نواری متمایز خود باشددانشمندان هنگام تشخیص بیماری ها و اختلالات به دنبال چه تغییراتی در کاریوتایپ هستند؟

Aa  Aa   Aa

کاریوتایپ فرآیند جفت شدن و مرتب کردن همه کروموزوم‌های یک ارگانیسم است، بنابراین یک عکس فوری ژنومی ازکروموزوم‌های یک فرد ارائه می‌کند. کاریوتایپ‌ها با استفاده از روش‌های رنگ‌آمیزی استاندارد شده تهیه می‌شوند که ویژگی‌های ساختاری مشخصه را برای هر کروموزوم نشان می‌دهد. سیتوژنتیک بالینی، کاریوتایپ های انسانی را برای تشخیص ژنتیک ناخالص تجزیه و تحلیل می کند.
تغییرات - ناهنجاری هایی که چندین مگاباز یا بیشتر از DNA را شامل می شود. کاریوتایپ ها می توانند تغییرات در تعداد کروموزوم های مرتبط با شرایط آنیوپلوئیدی، مانند تریزومی 21 (سندرم داون) را آشکار کنند. تجزیه و تحلیل دقیق کاریوتیپ ها همچنین می تواند تغییرات ساختاری ظریف تری را به عنوان حذف کروموزومی، تکرار، جابجایی یا وارونگی نشان دهد. در واقع، همانطور که ژنتیک پزشکی به طور فزاینده ای با پزشکی بالینی ادغام می شود، کاریوتایپ ها به منبع اطلاعات تشخیصی برای نقایص خاص مادرزادی، اختلالات ژنتیکی و حتی سرطان تبدیل می شوند.

تهیه کاریوتیپ از سلول های میتوتیک

کاریوتایپ ها از سلول های میتوزی که در متافاز متوقف شده اند تهیه می شوند.بخش پرومتافاز چرخه سلولی، زمانی که کروموزوم ها متراکم ترین ترکیبات خود را به خود می گیرند. انواع بافت ها را می

توان به عنوان منبع این سلول ها استفاده کرد. برای تشخیص سرطان، نمونه‌های معمولی شامل بیوپسی تومور یا نمونه‌های مغزاستخوان هستند. برای سایر تشخیص‌ها، کاریوتایپ‌ها اغلب از نمونه‌های خون محیطی یا بیوپسی پوست ایجاد می‌شوند. برای تشخیص قبل از تولد، از نمونه های مایع آمنیوتیک یا پرزهای کوریونی به عنوان منبع سلول استفاده می شود. فرآیند تولید کاریوتایپ با کشت کوتاه مدت سلول های مشتق شده از یک نمونه آغاز می شود. پس از یک دوره رشد و تکثیر سلولی، سلول های در حال تقسیم متوقف می شوند.متافاز با افزودن کلشی سین، که دوک میتوزی را مسموم می کند. سلول‌ها در مرحله بعدی با محلول هیپوتونیک درمان می‌شوند که باعث می‌شود هسته‌هایشان متورم شود و سلول‌ها ترکیده شوند. سپس هسته ها با یک تثبیت کننده شیمیایی درمان می شوند، روی یک لام شیشه ای ریخته می شوند و با لکه های مختلف درمان می شوند.  که ویژگی های ساختاری کروموزوم ها را نشان می دهد. الگوهای نواری جزئیات ساختاری کروموزوم ها را آشکار می کند.بدون هیچ درمانی، جزئیات ساختاری کروموزوم ها در زیر نور به سختی قابل تشخیص است میکروسکوپ بنابراین، برای موثرتر و کارآمدتر کردن آنالیز، سیتولوژیست‌ها لکه‌هایی را ایجاد کرده‌اند که با DNA متصل می‌شوند و الگوهای نواری مشخصی را برای مختلف ایجاد می‌کنند. کروموزوم ها قبل از توسعه این تکنیک های نواربندی، متمایز کردن کروموزوم ها از یکدیگر بسیار دشوار بودند و کروموزوم ها به سادگی بر اساس اندازه و محل قرارگیری سانترومرهایشان گروه بندی شدند.این در سال 1970 تغییر کرد، زمانی که Torbjorn Caspersson و همکارانش اولین تکنیک باندینگ را که به نام Q-banding شناخته می شود، توصیف کردند. Q-banding شامل استفاده از رنگ فلورسنت کیناکرین است، که DNA را آلکیل می کند و در طول زمان در معرض خاموش شدن است. کاسپرسون و همکاران نشان داد که کویناکرین الگوهای نواری مشخص و قابل تکرار را برای افراد تولید می کند کروموزوم ها از آن زمان، محققان انواع دیگری از تکنیک‌های باندبندی کروموزوم را توسعه داده‌اند که تا حد زیادی جایگزین Q-banding در سیتوژنتیک بالینی شده‌اند. امروز، بیشتر کاریوتیپ ها با رنگ گیمسا رنگ آمیزی می شوند که وضوح بهتری از نوارهای منفرد را ارائه می دهد.  آماده سازی پایدارتری تولید می کند و می توان آن را با میکروسکوپ میدان روشن معمولی تجزیه و تحلیل کرد.علل مولکولی برای تفاوت رنگ آمیزی در طول یک کروموزوم پیچیده و شامل ترکیب پایه DNA و تفاوت های موضعی در ساختار کروماتین است. در G_banding، نوع رنگ‌آمیزی گیمسا که بیشتر در آمریکای شمالی استفاده می‌شود، کروموزوم‌های متافاز ابتدا به طور خلاصه با تریپسین، آنزیمی که پروتئین‌ها را تجزیه می‌کند، درمان می‌شوند.  کروموزوم ها با Giemsa رنگ آمیزی می شوند. تریپسین تا حدی برخی از پروتئین های کروموزومی را هضم می کند، در نتیجه ساختار کروماتین را شل می کند و به رنگ گیمسا اجازه می دهد تا به DNA دسترسی پیدا کند.به طور کلی، مناطق هتروکروماتیک، که تمایل به داشتن DNA غنی از AT و نسبتاً فقیر از نظر ژن دارند، در G-banding تیره تر می شود. در مقابل، کروماتین متراکم کمتر - که تمایل به غنی بودن از GC دارد و از نظر رونویسی فعال تر است - رنگ گیمسا کمتری را در خود جای می دهد و این مناطق ظاهر می شوند.  به عنوان نوارهای سبک در G-banding. مهمتر از همه، G-banding الگوهای تکرارپذیر برای هر کروموزوم تولید می کند و این الگوها بین افراد یک گونه مشترک است. نمونه ای از کروموزوم های انسانی رنگ آمیزی شده با گیمسا، همانطور که در زیر میکروسکوپ ظاهر می شوند، در شکل 1 الف نشان داده شده است. به طور معمول، رنگ آمیزی Giemsa بین 400 تا 800 باند توزیع شده تولید می کند.  در میان 23 جفت کروموزوم انسانی. یک باند G که بر حسب DNA اندازه گیری می شود نشان دهنده آن است چندین میلیون تا 10 میلیون جفت باز DNA، کششی به اندازه ای طولانی که شامل صدها ژن باشد.

با این حال، G-banding تنها تکنیک مورد استفاده برای رنگ آمیزی کروموزوم ها نیست. R-banding که می باشد در بخش‌هایی از اروپا استفاده می‌شود، همچنین شامل رنگ گیمسا می‌شود، اما این روش برعکس الگوی G-banding را ایجاد می‌کند.در R-banding (شکل 1c)، کروموزوم ها قبل از اعمال رنگ گیمسا گرم می شوند. تصور می‌شود که عملیات حرارتی ترجیحاً مارپیچ DNA را در نواحی غنی از AT ذوب می‌کند که معمولاً لکه گیمسا را ​​قوی‌تر به هم متصل می‌کند و تنها مناطق نسبتاً غنی از GC را باقی می‌گذارد تا لکه را بگیرند. R-banding اغلب برای ارائه جزئیات مهم در مورد مناطق غنی از ژن که در نزدیکی تلومرها قرار دارند استفاده می شود. روش دیگری باندینگ C است (شکل 1d) که می تواند به طور خاص برای رنگ آمیزی هتروکروماتین سازنده یا DNA غیر فعال ژنتیکی استفاده شود، اما امروزه به ندرت برای اهداف تشخیصی استفاده می شود. C-banding یک تکنیک تخصصی Giemsa است که در درجه اول کروموزوم ها را در سانترومرها که دارای مقادیر زیادی DNA ماهواره ای غنی از AT هستند رنگ می کند.اولین روشی که برای شناسایی همه 46 کروموزوم انسانی مورد استفاده قرار گرفت، Q-banding بود (شکل 1b) که با رنگ آمیزی کروموزوم ها با کویناکرین و بررسی آنها در زیر نور UV به دست می آید. این روش برای بررسی جابه‌جایی‌های کروموزومی، به‌ویژه آنهایی که کروموزوم Y را درگیر می‌کنند، بسیار مفید است. روی هم رفته، این تکنیک‌های باندینگ زرادخانه‌ای از روش‌های رنگ‌آمیزی را برای تشخیص ناهنجاری‌های کروموزومی در اختیار سیتوژنتیک بالینی بیماران قرار می‌دهند.

سازماندهی کروموزوم ها در کاریوگرام برای بررسی

به منظور به حداکثر رساندن اطلاعات تشخیصی به دست آمده از یک آماده سازی کروموزوم، تصاویر کروموزوم های منفرددر قالبی استاندارد شده به نام a مرتب می شوند کاریوتایپ، یا دقیق تر، کاریوگرام (شکل 1a-c). طبق کنوانسیون های بین المللی، اتوزوم های انسانی یا کروموزوم های غیر جنسی از 1 تا 22 به ترتیب نزولی شماره گذاری می شوند.  اندازه، به استثنای کروموزوم های 21 و 22، اولی در واقع کوچکترین است.  اتوزوم کروموزوم های جنسی معمولاً در انتهای کاریوگرام قرار می گیرند.

در کاریوگرام، کروموزوم ها در امتداد یک محور افقی که با سانترومرهای آنها مشترک است، همسو می شوند. کروموزوم‌هایمنفرد همیشه با بازوهای کوتاه p نشان داده می‌شوند - p به معنی "ریزه کوچک"، کلمه فرانسوی "small" - در بالا، و بازوهای طولانی q آنها - q برای "صف" - در پایین. قرار دادن سانترومر همچنین می تواند برای شناسایی مورفولوژی یا شکل ناخالص استفاده شود کروموزوم ها به عنوان مثال، کروموزوم های متاسانتریک، مانند کروموزوم های 1، 3 و 16، دارای بازوهای p و q با طول تقریبا مساوی. کروموزوم های زیر متاسانتریک، مانند کروموزوم های 2، 6 و 10، دارای سانترومرهایی هستند که کمی از مرکز جابجا شده اند. کروموزوم های آکروسنتریک، مانند کروموزوم های 14، 15 و 21 دارای سانترومرهایی هستند که در نزدیکی انتهای خود قرار دارند. مرتب کردن کروموزوم ها در کاریوگرام می تواند شناسایی هر گونه ناهنجاری را ساده کند.  توجه داشته باشید که الگوهای نواری بین دو نسخه کروموزوم یا همولوگ هر کدام اتوزوم تقریباً یکسان هستند. برخی از تفاوت های ظریف بین همولوگ های یک معین کروموزوم را می توان به تنوع ساختاری طبیعی در بین افراد نسبت داد. گاه و بیگاه، مصنوعات فنی مرتبط با پردازش کروموزوم ها نیز آشکار خواهند شد تفاوت بین دو همولوگ، اما این مصنوعات را می توان با تجزیه و تحلیل 15-20 گسترش متافاز از یک فرد شناسایی کرد. بسیار بعید است که همان مصنوع فنی باشد به طور مکرر در یک نمونه داده شده رخ می دهد.

استفاده از کاریوگرام برای تشخیص ناهنجاری های کروموزومی

امروزه کاریوگرام باند G به طور معمول برای تشخیص طیف گسترده ای از ناهنجاری های کروموزومی در افراد استفاده میشود. اگرچه وضوح تغییرات کروموزومی قابل تشخیص با کاریوتایپ معمولاً چند مگاباس است، این می تواند برای تشخیص دسته های خاصی از بیماری ها کافی باشد.  ناهنجاری ها به عنوان مثال، آنیوپلوئیدی که اغلب به دلیل عدم وجود یا اضافه شدن a ایجاد می شود کروموزوم، با تجزیه و تحلیل کاریوتیپ به راحتی قابل تشخیص است. سیتوژنتیک ها همچنین اغلب می توانند حذف ها یا درج های بسیار ظریف تر را به عنوان انحراف از الگوهای نواری طبیعی تشخیص دهند. به همین ترتیب، جابجایی ها اغلب بر روی کاریوتیپ ها به راحتی آشکار می شوند.هنگامی که تغییرات منطقه ای در کروموزوم ها روی کاریوتیپ ها مشاهده می شود، محققان اغلب مشاهده می کنند علاقه مند به شناسایی ژن های کاندید در بازه بحرانی هستند که بیان نادرست آنها ممکن است باعث ایجاد علائم در بیماران شود. این فرآیند جستجو تا حد زیادی با تکمیل شدن تسهیل شده است پروژه ژنوم انسانی، که نوارهای سیتوژنتیکی را با اطلاعات توالی DNA مرتبط می کند. در نتیجه، محققان اکنون قادر به استفاده از طیف وسیعی از تکنیک‌های سیتوژنتیک مولکولی برای دستیابی به وضوح بالاتر تغییرات ژنومی هستند. هیبریداسیون فلورسانس درجا (FISH) و هیبریداسیون ژنومیک مقایسه ای (CGH) نمونه هایی از دو هستند.رویکردهایی که به طور بالقوه می توانند ناهنجاری ها را در سطح ژن های فردی شناسایی کنند. سیتوژنتیک مولکولی یک رشته پویا است و روش‌های تشخیصی جدید همچنان در حال توسعه هستند. از آنجایی که این فناوری‌های جدید در کلینیک پیاده‌سازی می‌شوند، می‌توان انتظار داشت که سیتوژنتیک‌ها بتوانند با افزایش کارایی از کاریوتیپ به ژن جهش کنند.